撰文｜谢万宇（2024级博士研究生）

审核｜闫致强

前言

“岂曰无衣”出自《诗经·秦风·无衣》，本为沙场征战的慷慨之问，此处借以喻指神经元与少突胶质细胞之间一场关于“衣”的对话。此处的“衣”有双重指向：神经元分泌LGI1，如同向少突胶质细胞发出“织衣”的指令——LGI1是神经元发给少突胶质细胞的“信使之衣”；少突胶质细胞收到信号后，合成髓鞘包裹神经元轴突，则是为神经元披上绝缘的“功能之衣”。从LGI1_D51G突变小鼠的白质异常出发，到最终鉴定出OPALIN为少突胶质细胞上LGI1的特异性受体，石云团队的研究完整地回答了“神经元如何通过LGI1指令少突胶质细胞织就髓鞘”这一核心问题——岂曰无衣？神经元有衣可发（LGI1），少突胶质细胞有衣可穿（OPALIN接收信号），最终神经元亦有衣可御（髓鞘）。

时间：2026年7月22日中午12:00

地点：科研北楼二层科创汇堂

报告人：石云 教授（广东省智能科学技术研究院）

主持人：闫致强 教授

题目：The multifaceted functions of LGI1 and its receptors

研究背景与出发点

LGI1：从癫痫因子到髓鞘调控者

癫痫是最常见的脑部疾病之一，其病因可能与突触传递异常有关。目前已有许多与癫痫相关的突变被发现于突触离子通道中，而这些通道正是当前抗癫痫药物的主要作用靶点。癫痫治疗的一个新潜在靶点是一类非离子通道型的癫痫相关蛋白。LGI1 （富亮氨酸胶质瘤失活蛋白1）是一个主要由神经元分泌的蛋白，其功能缺失与人类疾病密切相关：LGI1基因突变导致常染色体显性侧颞叶癫痫（ADLTE）；此外，边缘系统脑炎中针对LGI1的自身抗体与健忘、抽搐及认知功能障碍相关。在突触传递过程中，与ADAM22家族成员以及多种突触蛋白组构成一个突触蛋白网络，LGI1则通过该网络调控由AMPA受体介导的突触传递（图1）。

然而，LGI1的功能并非仅仅局限于神经元。早在 2010年，Silva等人首次报道Lgi1^-/-的小鼠存在髓鞘发育不全。而后，石云团队在一项前期工作中从一名中国ADLTE患者中鉴定出Lgi1基因上一个新的错义突变c.152A>G（p.Asp51Gly），该患者表现为运动平衡障碍和白质减少。依此构建的Lgi1^D51G/D51G小鼠同样表现出脑白质异常（WMAs）和髓鞘形成减少（图2）。进一步机制研究表明，LGI1可能通过TSC-mTOR通路和Sox10依赖性信号调控少突胶质细胞分化和髓鞘形成。该研究清晰地建立了从基因突变到髓鞘病变的因果联系，也直接促使他们去追问：“分泌蛋白LGI1究竟是如何作用于少突胶质细胞的？”

基于以上的研究，石云团队提出假设：少突胶质细胞膜上必然存在一个未知的LGI1受体，负责介导LGI1对髓鞘发育的调控作用，并着手设计一系列实验鉴定该“未知受体”。

OPALIN为LGI1的互作蛋白

1.1 OPALIN

石云团队采取的策略是对融合3×FLAG标签的重组LGI1蛋白进行纯化，随后使用小鼠脑裂解液进行亲和层析实验，并结合质谱分析（MS）（图3A）。由此他们成功鉴定出三种OPALIN（oligodendrocytic myelin paranodal and inner loop protein）的特异性肽段（图3B和C）。值得注意的是，OPALIN在小鼠脑中与MBP高度共定位（图3D），且在原代培养的少突胶质细胞突起和膜上广泛表达（图3E）。

OPALIN是一种少突胶质细胞特异性表达的I型跨膜蛋白，位于人类10q24.1染色体上。其蛋白结构包含一个胞外N端结构域（NTD）、一个跨膜结构域（TMD）和一个胞内C端结构域（CTD）。该蛋白在哺乳动物中高度保守，曾被预测参与髓鞘旁环的结构稳定及少突胶质细胞分化和髓鞘形成过程。然而，对其关键的功能验证研究却指向了矛盾的方向。一项发表在Glia的研究通过构建Opalin全身性敲除小鼠发现，敲除小鼠在基础髓鞘蛋白组成、少突胶质细胞谱系标志物表达以及髓鞘精细超微结构上均无明显异常，仅在新奇环境下的探索行为中表现出轻微影响。这说明在常规条件下，OPALIN对于中枢神经系统的髓鞘形成并非不可或缺。

1.2 LGI1与OPALIN有互作

想知道LGI1与OPALIN之间是否存在互作，他们进行了内源Co-IP及体外结合实验（图3F-I）：前者发现在小鼠脑裂解液中，anti-OPALIN抗体可共沉淀LGI1，反之亦然，证实两者在体内存在相互作用；后者通过在HEK293T细胞中表达OPALIN-HA后，外加LGI1-FLAG可观察到FLAG信号围绕OPALIN阳性细胞聚集；共表达时，anti-HA可共沉淀FLAG。这证明了LGI1与OPALIN存在直接的结合。综上共同表明了LGI1与OPALIN之间确存在直接的相互作用。

互作位点为OPALIN的N端结构域

2.1 OPALIN的NTD位于胞外

已知二者存在互作，需要进一步确定互作位点。首先对OPALIN的跨膜拓扑结构进行分析：通过分别构建HA-OPALIN（N端HA）和OPALIN-HA（C端HA）并在HEK293T细胞中进行通透与非通透染色，证实OPALIN的N端（NTD）位于胞外，C端（CTD）位于胞内（图4A,B）。

2.2 Lys23和Asp26是介导二者结合的关键残基

而后对关键位点进行筛查：删除短的NTD（OPALIN-ΔNTD）后，与LGI1的结合完全消失；对NTD上的候选残基进行丙氨酸扫描突变，发现双突变K23A/D26A可破坏与LGI1的结合，而单独突变或糖基化位点突变则无影响（图4C-F）。而Lys23和Asp26在哺乳动物的OPALINs中均具有保守性，表明它们与LGI1相结合的能力及对应的功能可能在进化上同样保守（图4G）。综上所述，OPALIN胞外N端的Lys23和Asp26是介导其与LGI1结合的关键残基，且在哺乳动物中高度保守。

OLs中的OPALIN缺失会导致WMA（白质脱髓鞘）和髓鞘减少

为了进一步明确OPALIN具体的生理功能，石云团队构建了Olig1-Cre; Opalinfl/fl  cKO（条件性敲除）小鼠模型，该策略可实现在少突胶质细胞谱系中特异性敲除Opalin。cKO小鼠在P14和P28均表现出胼胝体厚度减少（白质发育缺陷的标志）（图5A-C）。透射电镜显示髓鞘化轴突数量显著减少（图5D）。在分子层面上，髓鞘蛋白（MBP, PLP1, MAG）及对应mRNA水平均明显下降（图5E）。此外，cKO小鼠与LGI1缺失小鼠的表型高度一致，同样表现出白质损伤所致的严重的运动协调障碍。

OPALIN的缺失影响OL的分化进程

4.1 OPALIN缺失影响成熟的OL，而不影响前体细胞

还需明确OPALIN缺失的影响发生在少突胶质细胞发育中的哪一阶段，石云团队进一步探究了OPALIN的缺失对成熟的少突胶质细胞（OLs）以及少突胶质前体细胞（OPCs）的影响。结果显示，与对照组相比，OPALIN的缺失不影响OPC的数量，但会减少成熟的OL的数量（图5F-K）。

4.2 OPALIN可能通过mTOR信号通路以及Olig2/Sox10/Myrf轴来调控神经元样细胞的分化

OPALIN缺失所致髓鞘减少是基于什么分子机制？石云团队对cKO小鼠的脑组织进行了RNA测序（RNA-seq）分析，显示了包括一些髓鞘相关基因在内的210个基因表达的下调。其中Olig2和Sox10这两个参与神经胶质细胞分化的关键转录激活因子下调最为显著。qRT-PCR及WB的结果分别从mRNA及蛋白质水平进一步证实了其表达的降低（图6A-E）。此外，作为Sox10的下游靶点的Myrf也呈现相同的下调趋势。由于mTOR信号通路的增强活性可能会抑制Olig2和Sox10的表达，发现cKO小鼠磷酸化mTOR（p-mTOR）的水平较对照组同样有所增加，表明OPALIN的缺失可能会导致mTOR信号通路的激活。综上所述，OPALIN可能通过mTOR信号通路以及Olig2/Sox10/Myrf轴来调控OL的分化。

4.3 OPALIN在OL分化而非OPC增殖中起关键作用

为进一步验证OPALIN的缺失影响OL的分化，他们首先进行了BrdU Birth-dating实验（BrdU可标记所有在注射期间新生的细胞，P7开始连续3天注射，P14取脑；CC1特异性标记成熟OL），结果显示cKO小鼠的BrdU⁺CC1/CC1⁺显著下降（图6F-H），提示少突胶质细胞分化受阻；而后进BrdU Pulse-labelin实验（BrdU P单次注射，并在注射后1小时立即取脑以标记正处于DNA复制期的细胞；PDGFRα特异性标记OPC），结果显示cKO小鼠BrdU⁺PDGFRα⁺/PDGFRα⁺无明显改变（图5K），说明OPALIN缺失并不影响OPC的增殖能力；Ki67/Olig2免疫染色（Ki67是细胞增殖的通用标志物，Olig2是少突胶质细胞谱系的标志物）的结果显示Ki67⁺Olig2⁺/Olig2⁺同样无明显改变（图6I-J），进一步证实OPALIN缺失不影响OPC增殖。

4.4 OPALIN的缺失不影响神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞

那么除了小胶质细胞之外，OPALIN缺失是否会影响大脑中的其他细胞？他们进行了补充实验，结果显示与对照组相比cKO小鼠皮层中NeuN+神经元数量及NeuN蛋白水平均无明显改变，提示神经元发育无显著缺陷。此外，NF200蛋白水平无明显改变，表明轴突无变化；突触蛋白（包括Synapsin1、PSD95和GluA1）的水平在对照组与Opalin cKO小鼠之间同样无显著差异（图7A-D）。值得注意的是，OPALIN的缺失同样并未改变星形胶质细胞或小胶质细胞的数量（图7E-H）。此外，TUNEL检测未在Opalin cKO小鼠和对照小鼠中检测到细胞凋亡（图7I）。综上，OPALIN的缺失不会影响神经元、小胶质细胞或星形胶质细胞，也不会导致细胞凋亡。

4.5 OPC中诱导性敲除Opalin导致髓鞘形成不足

前面通过常规条件性敲除（cKO，即从胚胎发育早期就开始敲除）已经证实OPALIN缺失会影响少突胶质细胞分化。但这里存在一个疑问：观察到的表型是OPALIN在OPC（少突胶质前体细胞）中的直接作用，还是由于早期发育中的间接或代偿效应？因为cKO小鼠在发育早期（Olig1-Cre从胚胎E10.5就开始表达）就缺失了OPALIN，不排除其他细胞或发育阶段产生了补偿机制。因此，他们构建了诱导性条件性敲除（icKO）小鼠：将Opalin^fl/fl小鼠与NG2-CreERT2小鼠杂交，在P3开始连续3天的他莫昔芬给药，以实现特定时间窗口（出生后早期）和特定细胞类型（OPC及其后代）中精准敲除Opalin，避免早期发育代偿（图8A、B）。

结果显示：icKO小鼠同样存在白质缺陷，髓鞘结构蛋白的减少，成熟OLs的减少，OPC的不受影响以及分化过程的受损（图8C-L）。说明在出生后发育窗口期，从OPC阶段敲除OPALIN就足以导致髓鞘形成不足和OL分化缺陷，排除了早期发育代偿的可能性，确认了OPALIN在OL分化中的直接且必需的作用。

LGI1-OPALIN相互作用对OL发育是必需的

前面已经证明OPALIN是LGI1的受体，并且鉴定了OPALIN上与LGI1结合的关键氨基酸（K23/D26）。现在要回答的核心问题是：OPALIN促进髓鞘形成的功能，到底是不是依赖于它与LGI1的结合？

他们设计了过表达拯救实验：向icKO小鼠侧脑室注射AAV（腺相关病毒），携带OPALIN-WT（野生型）或OPALIN-K23A/D26A（无法结合LGI1的突变体），在P0注射、P3-P5给他莫昔芬、P28检测（图9A、B）。经过MRI评估（通过分数各向异性（FA）值评估白质微结构完整性——FA值反映水分子在脑组织中的定向扩散程度，髓鞘越完整、纤维越致密，FA值越高）以及MBP⁺纤维、CC1⁺细胞数、髓鞘蛋白（MBP/CNPase）水平、Sox10⁺细胞数及蛋白水平、mTOR信号活性在内的多维度检测，结果显示：OPALIN-WT可显著恢复FA值、MBP⁺纤维和CC1⁺细胞数量，而OPALIN-K23A/D26A完全无法拯救上述任何缺陷；此外OPALIN-WT可恢复Sox10表达和mTOR 信号，而突变体则无效（图9C-H）。

为进一步证明OPALIN的功能确实需要LGI1，他们在icKO小鼠回补OPALIN-WT的同时，用shRNA 敲低LGI1。结果显示：敲低LGI1后，OPALIN-WT 的拯救效果被显著削弱——髓鞘蛋白（MAG/MBP/PLP1/CNPase）水平下降，MBP+ 髓鞘和CC1⁺细胞数量减少。这从反面证明：即使有正常的OPALIN，缺少配体LGI1也无法发挥功能。

综上，OPALIN促髓鞘形成的功能严格依赖于其与 LGI1的物理结合，LGI1-OPALIN是一个功能偶联的信号复合体。

LGI1-OPALIN轴参与LGI1缺失小鼠中髓鞘缺陷

前面的工作已经证明LGI1缺失会导致髓鞘缺陷，也证明OPALIN是LGI1的受体。现在要建立完整的因果链条：LGI1通过OPALIN介导其促髓鞘功能——即LGI1缺失小鼠的髓鞘表型，是否确实是因为LGI1无法与OPALIN结合所导致的？

他们首先确定了LGI1上结合OPALIN的结构域：通过Co-IP实验发现，LGI1通过其C端的EPTP结构域与OPALIN结合（图10A、B）。EPTP结构域由七个β-折叠片（称为EPTP1-7）组成。通过将LGI1 的每个叶片逐一替换为LGI2的对应片段（LGI2不与OPALIN结合），发现只有将EPTP7替换为LGI2 的版本时，LGI1才失去与OPALIN的结合能力（图10C）。这说明EPTP7是LGI1结合OPALIN的关键区域。

随后同样进行了拯救实验：在Lgi1全敲除小鼠（Lgi1^-/-）中分别回补LGI1-WT（能与OPALIN结合）和LGI1^LGI2(EPTP7)突变体（不能与OPALIN结合），然后在P28检测髓鞘蛋白水平。结果显示：Lgi1^-/-小鼠回补LGI1-WT后，髓鞘蛋白（MAG/MBP/PLP1/CNPase）水平显著恢复；而回补LGI1^LGI2(EPTP7)突变体的小鼠，髓鞘蛋白水平仍处于低水平，与未处理的Lgi1^-/-小鼠无差异（图10D-F）。综上，LGI1必须通过其EPTP7结构域与 OPALI结合，才能发挥促髓鞘形成的功能。LGI1-OPALI相互作用LGI调控髓鞘发育的核心机制。

Model：

OPALIN在少突胶质细胞中作为LGI1的受体。OPALIN的缺失会导致大脑髓鞘形成减少，表型类似于LGI1缺陷小鼠。OPALIN的缺失会下调Sox10 和Olig2的表达，从而抑制少突胶质细胞的分化。通过AAV载体重新表达野生型OPALIN，但不包括 LGI1结合位点突变体（OPALIN_K23A/D26A），可逆转Opalin基因敲除小鼠中的髓鞘减少和白质萎缩现象。

总结：

1. LGI1-OPALIN：一个新的受体-配体对

过往已知LGI1在神经元上的受体是 ADAM22/ADAM23（调控AMPAR转运和突触功能）和轴突上的NgR1（调控轴突生长）。本研究首次鉴定出OPALIN是少突胶质细胞上LGI1的特异性受体。

2. 髓鞘发育的“神经元-少突胶质细胞”对话

揭示了一种新的跨细胞信号通讯模式：神经元分泌 LGI1，作用于少突胶质细胞上的OPALIN受体，进而调控OL分化和髓鞘形成。这一机制为“神经元活动如何影响髓鞘可塑性”提供了潜在的分子解释——神经元的电活动可能通过调控LGI1的分泌或表达，来影响邻近少突胶质细胞的髓鞘化行为。

3. 与疾病的关联

LGI1突变/抗体相关疾病（ADLTE、边缘叶脑炎）中常伴随白质异常，但此前机制不清。本研究明确指出：LGI1-OPALIN轴受损是髓鞘缺陷的直接原因。这为临床上LGI1相关疾病中认知功能障碍（可能部分源于白质损伤）提供了新的病理解释，也提示OPALIN或其下游通路可作为潜在的治疗靶点。

思考:

这是一项扎实的分子-细胞-发育神经生物学研究，从LGI1到OPALIN的完整叙事已然清晰：神经元分泌LGI1，如同发出一件“信使之衣”，经由少突胶质细胞膜上的OPALIN受体承接，激活下游Sox10/Olig2信号轴，驱动少突胶质细胞分化并合成髓鞘——最终将这层绝缘之衣回赠予神经元轴突。“岂曰无衣”的追问，在这一来一往的分子对话中得到了圆满的回答：神经元有衣可发（LGI1），少突胶质细胞有衣可接（OPALIN），轴突有衣可御（髓鞘）。三件“衣”，环环相扣，缺一不可。这项研究不仅填补了LGI1在髓鞘发育中受体空缺的关键一环，也为LGI1相关癫痫及脑白质疾病的治疗提供了崭新的靶点。从受体发现→敲除表型→结合位点鉴定→功能拯救→因果验证，终为“无衣”的困境找到了有据可依的答案。

研究逻辑闭环严密，值得我们在自己设计实验时借鉴学习。

当然批判地来看仍有美中不足之处:

1.缺少下游信号通路的深入验证：虽然观察到了 Sox10/Olig2和mTOR的变化，但LGI1-OPALIN 如何从膜受体信号传导到核内转录因子的过程仍未阐明。

2.未涉及疾病模型验证：没有在LGI1抗体阳性脑炎或ADLTE疾病模型中验证靶向OPALIN的治疗潜力。

1. Yamagata A, Fukai S. Insights into the mechanisms of epilepsy from structural biology of LGI1-ADAM22. Cell Mol Life Sci. 2020 Jan;77(2):267-274. doi: 10.1007/s00018-019-03269-0. Epub 2019 Aug 20. PMID: 31432233; PMCID: PMC11104983.

2. Teng XY, Hu P, Chen Y, Zang Y, Ye X, Ou J, Chen G, Shi YS. A novel Lgi1 mutation causes white matter abnormalities and impairs motor coordination in mice. FASEB J. 2022 Mar;36(3):e22212. doi: 10.1096/fj.202101652R. PMID: 35167164.

3. Teng XY, Hu P, Zhang CM, Zhang QX, Yang G, Zang YY, Liu ZX, Chen G, Shi YS. OPALIN is an LGI1 receptor promoting oligodendrocyte differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Aug 6;121(32):e2403652121. doi: 10.1073/pnas.2403652121. Epub 2024 Jul 31. PMID: 39083419; PMCID: PMC11317624.